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講者：浙江大學醫學院附屬口腔醫院 王媛博士

主辦單位： PacBio APAC Team

細菌已有34億年的歷史，且在人類生活中是無所不在的，胎兒在母體中就已經開始接觸微生物，並在分娩與成長過程中逐漸建立並完善自己的微生物菌相。在2016研究指出，人體細胞和微生物數量幾乎為1:1，而口腔為人體消化道的起始端，是人體微生物菌相很重要的一個部分！你知道嗎？接吻10秒就會有八千萬個口腔菌群進行交換呢！有越來越多的研究顯示，許多疾病（肝硬化、部分心血管疾病、免疫疾病）其微生物菌相的改變都可以追溯到口腔微生物。

此研究團隊主要研究口腔細菌造成齲齒的議題，齲齒若不及時治療，會引發牙髓炎、根尖周炎，或是進入血液中引發細菌性心內膜炎等。表格顯示在2010全球疾病負擔，發病前十名的就有兩項和齲齒有關：恆牙齲及乳牙齲，並且在WHO和中國的健康調查都顯示全球齲齒的發病率都在上升中，而2018年中國5歲兒童的發病率比十年前提升了5.8%，口腔微生物的存在是齲齒發生的先決條件，因此研究口腔微生物和齲齒的連結非常重要的。

此團隊從2010年開始研究，在2016年使用了Illumina定序平台：MiSeq (研究健康到齲齒發生的口腔微生物變化) 與 HiSeq2000 (研究Metagenomics功能性預測)，但Illumina短讀長定序雖然能快速給出龐大的數據量，但因為其只有200-300bp的長度，為後續基因的組裝及預測帶來了困難。為了兼顧高通量和讀長長的優勢，在2017年使用了PacBio SMRT定序，以其長讀長及高準確性為此研究提供了新的技術。

PacBio SMRT定序可以對口腔微生物菌相中物種16S rRNA全長進行定序，而MiSeq僅能進行16S rRNA V3-V4區域進行定序。在定序深度與稀釋曲線 (Rarefaction curve) 都趨於飽和的前提下進行兩種平台的比較。在屬水平 (Genus-level) 上，在MiSeq平台有0.68% 無法被分類，而PacBio平台全部的菌相都可以被分類至屬水平；更進一步分析在種水平 (Species-level) 的比例，有超過50%的物種在MiSeq平台上無法被精確分辨，而PacBio平台無法鑑定的物種比例僅有0.03%，在此案樣品中僅有1株未知口腔菌，其餘皆可精確分類。下圖為將常見的口腔微生物挑選出來進行分析，黑色區塊表示無法被分類的細菌比例，明顯看到MiSeq平台在特定屬有極高比例無法被分類 (71.1 ~ 98.8%)。因此，相對於短讀長定序，PacBio平台在種水平 (Species-level) 有更高的物種分辨率。

細菌劃分「種」的分類為DNA同源序列要達到70%，而「同屬不同種」的相似度為25~70%，有許多差異很大的細菌還是被歸類在同一屬，因此，利用屬水平來進行微生物菌相和疾病關聯性是不足的，因此選擇PacBio SMRT定序，其分析可以到種水平 (Species-Level)，甚至菌株水平 (Strain-Level)，在微生物研究中具有優勢。

而透過健康兒童和齲齒兒童的口腔菌相比較，PacBio平台定序除了可以在種水平區分了齲齒特異性細菌和健康特異性細菌外，更找到了目前文獻尚未報導過的四株可疑致齲菌。在實驗的六個月中，有五例兒童從健康轉變為齲齒，分類為易感族群，並找出了在齲齒發生的主要菌種。