>

次世代定序

【NGS 16S報告升級】第一章:微生物菌相研究最佳利器-不可不知的16S rDNA定序!

前言

環境與生物體中存在有各種微生物,而其交互作用遠比我們所知的更加複雜;近年來,環境微生物學與腸道微生物學更是成了一主流研究項目,無論是探討微生物和疾病間的關聯,或是環境變遷(無論是水樣、土樣、空氣等)等議題,都已離不開微生物菌相研究。隨著次世代定序 (Next Generation Sequencing) 的蓬勃發展,16S rDNA 定序法 (16S rDNA Sequencing) 則是現在最廣為使用的策略,可提供高品質且高通量的數據產出,並精準又快速的執行菌相分析。

16S rDNA 定序法是什麼呢?

16S核醣體RNA (16S rRNA) 是原核生物核醣體的重要組成部分。它的基因 (16S rDNA) 長度約為 1.5 kb,由 9 個高度變異區 (V1 - V9) 和幾個保守區域(conserved region) 所組成。透過PCR擴增和定序,即可根據其鹼基序列的差異,確認環境或生物體中的微生物種類和群落;若覆蓋的變異區域越多,則分類物種可更加準確。隨著定序技術的進步,16S rDNA定序已被廣泛應用,研究者可以直接萃取樣本DNA進行定序,沒必要去透過菌落培養得到菌相基因。此策略可以更快速準確地獲取環境微生物訊息,揭示多樣性未知的微觀生命,得以瞭解複雜的微生物世界。

目前基米採用 Illumina MiSeq 300 pair-end 定序模式,定序區域為V3 – V4變異區,提供高品質且高通量的數據產出,並不斷優化生資分析流程,選用單一解析度更高的ASV (Amplicon Sequence Variants) ,採用Qiime2最新版的微生物體資料平臺,升級報告內容,讓客戶能夠獲得最精確與豐富的圖表呈現。

圖一、使用高專一性引子(341F 與 805R)增幅16S rDNA的V3–V4區域,並使用Illumina MiSeq 300 pair-end定序模式。

分析工具升級-DADA2 & Qiime2

DADA2 ( Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2) 是一種校正擴增子序列錯誤的演算模型,採用降噪 (Denoising) 的方法獲得解析度更高的Amplicon Sequence Variants (ASV)。

如圖二所示,在進行16S定序實驗時,多少會產生PCR放大錯誤 (PCR error)、定序錯誤 (sequencing error) 或嵌合體 (chimera) 等錯誤序列,有別於過往研究常使用的OTU聚類方法,雖採97% 序列相似程度進行聚類,但OTU仍無法代表一個物種,因而限制了微生物分類之準確性。而藉由DADA2降噪分析運用序列的豐度、品質分數等資訊,得以糾正錯誤鹼基,使單一鹼基解析度更高,能夠減少錯誤並維持高靈敏度,這也是ASV能夠保留序列變異而不失真的優勢。

圖二、DADA2採用降噪(Denoising)的方法獲得鹼基解析度更高ASV。

圖三、QIIME2為目前主流的微生物體資料分析平台。

經過DADA2運算後的ASV將透過QIIME2 Naive-Bayes classifier (v2019.10) 搭配SILVA資料庫以99%之相似程度進行物種註釋。QIIME2是微生物體領域最廣泛使用的分析流程,具有再現性 (Reproducible) 、互動性 (interactive)、規模性 (scalable)、可擴展性 (extensible) 等優勢,根據Google學術截至2022/5/9 已有5133次引用次數,是目前最主流且公信力極高的微生物分析平台。


 

你還在看舊報告嗎?
基米16S生資分析報告大升級
全中文化報告,輕鬆閱讀,完整理解!
若需了解更詳細的報告內容,歡迎洽詢NGS業務或
聯繫我們索取範例報告!